Kariotip — metode analize i indikacije
Osnovni pojam kariotipa i kariograma, kao i postupak njegove izrade (kolhicin, hipotonični rastvor, Giemsa bojenje), već su opisani na stranici Hromozomi — struktura i organizacija. Ova stranica ide dalje: kako se hromozomi zapravo raspoznaju pod mikroskopom preko različitih tehnika bojenja, koliko sitne promjene kariotip uopšte može da vidi, i kada se u kliničkoj praksi naručuje.
Tehnike bojenja. Najčešća tehnika je G-pruge (G-banding): hromozom se prvo blago razgradi tripsinom, pa oboji Giemsa bojom. Rezultat je niz svijetlih i tamnih pruga - tamne pruge odgovaraju heterohromatinu, regijama bogatim adeninom i timinom koje se kasno repliciraju i sadrže malo gena, dok svjetlije pruge odgovaraju euhromatinu, gensko bogatijim, GC-bogatijim regijama koje tripsin/Giemsa kombinacija manje boji. G-pruge u standardnom prikazu daju otprilike 300-400 prepoznatljivih pruga po kompletnom setu hromozoma.
R-pruge (R-banding, "reverse") daju potpuno obrnutu sliku: dobijaju se drugačijim postupkom (zagrijavanje u fosfatnom puferu prije bojenja, koje razdvoji slabije vezane, AT-bogate regije), pa su kod R-pruga TAMNE baš one, GC-bogate/euhromatinske regije koje su kod G-pruga svijetle, i obrnuto. R-pruge se posebno koriste za analizu telomernih regija hromozoma, koje su na G-prugama često svijetle i teško uočljive, ali na R-prugama postaju tamne i lakše se prate za delecije ili translokacije baš na krajevima hromozoma.
C-pruge (C-banding) su treća, uža tehnika - Giemsa boja se ovdje veže specifično za konstitutivni heterohromatin, pa oboji centromere, za razliku od G-pruga koje boje čitav hromozom u naizmjeničnom obrascu.
Rezolucija - šta se vidi, šta ne. Kariotip daje pregled cijelog genoma, ali samo na nivou velikih promjena - detektuje aneuploidije i strukturne promjene veće od otprilike 5 megabaza (5 miliona parova baza). Sve manje ili "kriptične" promjene - mikrodelecije, mikroduplikacije, a pogotovo tačkaste mutacije koje mijenjaju samo jedan nukleotid - ostaju potpuno nevidljive klasičnom kariotipu; njihovo otkrivanje traži druge, precizniji pristup, koji je tema zasebne stranice u ovoj oblasti.
Kliničke indikacije. Kariotip se u praksi naručuje u četiri glavne situacije. Prenatalno - kod napredne starosti majke (preko 35 godina), abnormalnog nalaza na biohemijskom skriningu, sumnjivog ultrazvučnog nalaza, ili porodične istorije hromozomskih abnormalnosti; uzorak se dobija amniocentezom ili biopsijom horionskih čupica. Postnatalno/pedijatrijski - kad dijete ili odrasla osoba pokazuje simptome koji upućuju na genetski poremećaj (npr. razvojno kašnjenje nepoznatog uzroka). Reproduktivno - kod parova sa ponovljenim gubitkom trudnoće ili neplodnosti; ovdje se kariotip radi i roditeljima (da se prepozna da li jedan od njih nosi balansiranu translokaciju koja je sama po sebi bezopasna, ali može kod potomstva rezultovati nebalansiranom, štetnom verzijom) i tkivu samog pobačaja (da se utvrdi da li je konkretan gubitak trudnoće bio uzrokovan hromozomskom abnormalnošću fetusa). Onkološko/hematološko - kod akutnih leukemija se kariotip rutinski radi na uzorku koštane srži, ne periferne krvi, jer je brza citogenetska procjena ključna za procjenu rizika i izbor terapije.
Česta zabuna
Čest je utisak da kariotip otkriva svaku genetsku grešku. U stvarnosti kariotip vidi samo velike promjene - iznad otprilike 5 megabaza. Tačkasta mutacija (promjena jednog jedinog nukleotida) je red veličina manja od te granice i kariotipom se nikad ne vidi, kao ni većina mikrodelecija i mikroduplikacija - za te promjene su potrebne osjetljivije, molekularne tehnike.
Druga česta zabuna je miješanje G-pruga i R-pruga po pitanju koja je tamna gdje. Kod G-pruga, tamne pruge su AT-bogate, heterohromatinske regije. Kod R-pruga je situacija tačno obrnuta - tamne pruge su GC-bogate, euhromatinske regije, baš one koje su kod G-pruga svijetle.
Klinička korelacija
Philadelphia hromozom je klasičan primjer strukturne abnormalnosti otkrivene kariotipom, ali sa važnom razlikom od primjera poput Daunovog sindroma: to je stečena, ne naslijeđena promjena. Nastaje recipročnom translokacijom između hromozoma 9 i 22, t(9;22), koja spaja dio ABL1 gena sa BCR regijom i stvara fuzioni onkoprotein BCR-ABL1 - konstitutivno aktivnu tirozin kinazu koja pokreće nekontrolisano umnožavanje bijelih krvnih zrnaca. Nalazi se u velikoj većini slučajeva hronične mijelogene leukemije, ali isključivo u ćelijama koštane srži zahvaćene osobe - nastaje tokom života u jednoj hematopoetskoj matičnoj ćeliji, nije prisutna u polnim ćelijama i ne prenosi se na potomstvo, za razliku od urođenih hromozomskih poremećaja opisanih na prethodnim stranicama.
Izvori
- StatPearls (NCBI Bookshelf): "Genetics, Cytogenetic Testing and Conventional Karyotype", "Genetics, Chromosome Abnormalities", "Amniocentesis", "Recurrent Pregnancy Loss", "Chronic Myelogenous Leukemia", "Laboratory Evaluation of Acute Leukemia" - primarni izvor teksta za ovu stranicu (OpenStax Biology 1e ne pokriva tehnike bojenja niti organizovane kliničke indikacije van generičkog pomena Giemsa boje)
- MedlinePlus Genetics (NLM/NIH): "Karyotype Genetic Test", "Karyotyping" (Medical Encyclopedia)
- Wikipedia: Karyotype, G banding, R-banding, Philadelphia chromosome (unakrsna provjera i dopuna)