Stranice o kariotipu i molekularnoj citogenetici su već pokazale kako se vide velike promjene (kariotip, od otprilike 5 megabaza) i srednje velike, ciljane promjene (FISH, mikroniz/CMA). Ova stranica ide dublje - kako se čita i umnožava sama sekvenca DNK, do nivoa pojedinačnog nukleotida.

PCR - umnožavanje poznate sekvence. Lančana reakcija polimeraze (PCR) je tehnika koja umnožava tačno određen segment DNK milionima puta, koristeći Taq polimerazu - termostabilnu DNK polimerazu izolovanu iz bakterije Thermus aquaticus (koja živi u vrelim izvorima, otud otpornost na visoku temperaturu). Svaki ciklus ima tri koraka: denaturacija na oko 95°C razdvaja dvolančanu DNK u dvije jednolančane niti, annealing (temperatura zavisi od dizajna prajmera, izvori navode raspone otprilike od 50°C do 70-ak °C) omogućava kratkim vještačkim prajmerima (20-25 nukleotida) da se vežu za komplementarnu sekvencu sa obje strane ciljanog regiona, a ekstenzija (oko 75-80°C) je korak u kom polimeraza sintetiše novi lanac u smjeru 5'→3' (isti smjer sinteze već objašnjen na stranici o replikaciji DNK). Pošto novosintetisani lanci sami postaju šabloni za sljedeći ciklus, količina ciljne sekvence se udvostručuje svaki put - nakon 30ak ciklusa nastaju milioni do milijarde kopija. Metodu je razvio Kary Mullis početkom 1980-ih, za šta je dobio Nobelovu nagradu. Ograničenja PCR-a proizilaze direktno iz principa: prajmeri moraju biti dizajnirani za POZNATU sekvencu (metoda ne može otkriti nepoznat patogen ili nepoznatu mutaciju), a izuzetna osjetljivost čini reakciju podložnom kontaminaciji - tragovi tuđe DNK u uzorku mogu dati lažno pozitivan rezultat.

RT-PCR - kad je šablon RNK, ne DNK. RT-PCR (reverse transcription PCR) dodaje jedan korak PRIJE standardnog PCR ciklusa: enzim reverzna transkriptaza (porijeklom iz retrovirusa) prepisuje RNK šablon u komplementarnu DNK (cDNA), koja se tek onda amplifikuje uobičajenim PCR postupkom. Ovo je nužno kad je cilj RNK, ne DNK - npr. mjerenje ekspresije gena (koliko se neki gen trenutno prepisuje) ili detekcija RNK virusa (influenca, HIV kao retrovirus, i drugi).

qPCR / real-time PCR - druga osobina, ne isti pojam kao RT-PCR. Real-time PCR prati amplifikaciju TOKOM same reakcije, fluorescentnim bojama ili probama, umjesto da se produkt analizira tek NAKON završetka (kao kod konvencionalne PCR, npr. gel elektroforezom). Broj ciklusa potreban da fluorescencija pređe prag detekcije zove se Ct (cycle threshold) ili, po novijoj terminologiji, Cq (quantification cycle) - Ct je obrnuto proporcionalan početnoj količini ciljne sekvence u uzorku: niži Ct znači veću početnu količinu (npr. veće virusno opterećenje). Bitno je razdvojiti dva pojma koja dijele istu skraćenicu u svakodnevnoj upotrebi - detaljnije u "Česta zabuna" ispod.

Sanger sekvenciranje - tačnost prije obima. Metoda terminacije lanca, koju je razvio Fred Sanger 1977, čita tačan redoslijed nukleotida jednog gena ili regiona. Princip: DNK polimeraza tokom sinteze nasumično ugrađuje, pored običnih nukleotida, i male količine fluorescentno obilježenih dideoksinukleotida (ddNTP) - kad se ugradi ddNTP, sinteza tog lanca se zaustavlja jer ddNTP nema 3'-OH grupu potrebnu za nastavak. Rezultat je skup lanaca različite dužine, svaki obojen prema tome kojim je ddNTP-om završen; automatizovano sekvenciranje (kapilarna elektroforeza, od 1987) čita tu boju po redu i daje hromatogram - grafički prikaz čitave sekvence. Tačnost je 99,99%, otud Sanger ostaje "zlatni standard" za validaciju - uključujući potvrdu nalaza dobijenih NGS metodama ispod - ali obrađuje samo jedan region po reakciji, pa je za genom-široke analize u velikoj mjeri zamijenjen sekvenciranjem nove generacije.

NGS - sekvenciranje nove generacije. Za razliku od Sangera koji čita jedan region po reakciji, NGS (masivno paralelno sekvenciranje) istovremeno čita milione fragmenata, dajući genom-širok pregled u jednom prolazu. Tri nivoa obima, od najužeg do najšireg: ciljani panel gena traži varijante u odabranoj grupi gena povezanih sa sličnim kliničkim slikama (brže i jeftinije od testiranja gen-po-gen, ali vidi SAMO gene uključene u dizajn panela); sekvenciranje egzoma (WES) čita sve kodirajuće regione, oko 180.000 egzona koji čine samo 1-2% cijelog genoma ali sadrže većinu trenutno poznatih varijanti koje uzrokuju bolest - koristi se kad je testiranje panela bilo bezuspješno ili kliničke karakteristike ne upućuju jasno na jedno stanje; sekvenciranje cijelog genoma (WGS) čita i kodirajuće i nekodirajuće regione, sa prednošću jednostavnije pripreme uzorka i mogućnošću da otkrije strukturne varijante i prekide u nekodirajućim dijelovima koje WES ne vidi. Dijagnostička korisnost WES-a i WGS-a je slična, generalno u rasponu 20-30% - WGS "vidi više" kvalitativno (širi tip promjena), ne nužno više dijagnostikuje u opštoj populaciji; korisnost raste kad se testira cijela porodica (trio: pacijent plus oba roditelja) umjesto samo pacijenta.

VUS - cijena šireg testa. Što je test širi (panel → egzom → genom), to se otkriva više varijanti neizvjesnog značaja (VUS) - promjena u sekvenci čiji je uticaj na zdravlje nepoznat, koja ne zadovoljava kriterijume ni za patogenu ni za benignu klasifikaciju u standardnom petostepenom sistemu (benigna / vjerovatno benigna / neizvjesnog značaja / vjerovatno patogena / patogena). VUS nalaz ne potvrđuje niti isključuje dijagnozu - ostavlja pitanje otvorenim. Sa vremenom, kako se prikupljaju dodatni podaci o istoj varijanti kod drugih pacijenata i u populaciji, VUS se često prekvalifikuje, najčešće ka benignoj kategoriji - zato je VUS bolje shvatiti kao privremenu nesigurnost nego kao konačan nalaz.